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摘要：目的探討腹部手術(shù)操作對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力和海馬CA1區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性神經(jīng)元的影響以及石杉?jí)A甲干預(yù)的結(jié)果。方法20月齡Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為對(duì)照組、麻醉組、手術(shù)組和石杉?jí)A甲組，石杉?jí)A甲組手術(shù)前給予石杉?jí)A甲灌胃3w，3w后手術(shù)組與石杉?jí)A甲組行脾切除術(shù)。術(shù)后1、3、7d進(jìn)行水迷宮測(cè)試，術(shù)后7d取腦使用免疫組織化學(xué)法觀測(cè)海馬CA1區(qū)ChAT的表達(dá)。結(jié)果術(shù)后1d進(jìn)行水迷宮測(cè)試，與對(duì)照組比較，麻醉組、手術(shù)組潛伏期和游泳距離均延長(zhǎng)(P<0.05);術(shù)后3d，與對(duì)照組比較，手術(shù)組、石杉?jí)A甲組潛伏期和游泳距離進(jìn)一步延長(zhǎng)，而石杉?jí)A甲組與手術(shù)組比較,潛伏期和游泳距離均縮短(P<0.05);術(shù)后7d，手術(shù)組與對(duì)照組比較,潛伏期和游泳距離延長(zhǎng)程度縮小。術(shù)后7d，與對(duì)照組、石杉?jí)A甲組比較，手術(shù)組的平臺(tái)象限停滯時(shí)間百分比以及在平臺(tái)象限游泳距離占總游泳距離百分比均減小(P<0.05)。術(shù)后7d，手術(shù)組海馬CA1區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組和石杉?jí)A甲組增多(P<0.05)。結(jié)論老年大鼠脾切除術(shù)后早期可出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙(POCD)，海馬CA1區(qū)ChAT表達(dá)上調(diào)，預(yù)先給予石杉?jí)A甲0.15mg/kg(連續(xù)3w)可以改善POCD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能。

關(guān)鍵詞：老年大鼠;術(shù)后認(rèn)知功能障礙;膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶;海馬;石杉?jí)A甲

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)現(xiàn)在臨床上廣泛關(guān)注，老年人由于機(jī)體退行性變導(dǎo)致術(shù)后早期POCD的發(fā)生率大大增加，但其發(fā)生機(jī)制不甚清楚。腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)在高級(jí)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用〔1〕，但在POCD發(fā)生機(jī)制中的作用并不清楚。我們選擇反應(yīng)膽堿能神經(jīng)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)作為觀察指標(biāo)，旨在研究其與POCD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探討POCD的發(fā)生機(jī)制。另一方面，目前對(duì)POCD預(yù)防和治療的有效性研究較少，為探討對(duì)POCD的治療策略，我們對(duì)脾切除術(shù)后大鼠POCD進(jìn)行藥物干預(yù)研究。以往研究表明石杉?jí)A甲(HuperzineA,HupA)具有很好的抗衰老和改善學(xué)習(xí)記憶功能作用〔2〕，本文從神經(jīng)生理學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)兩方面研究該藥對(duì)大鼠脾切除POCD的影響。

1材料與方法

1.1藥物與試劑石杉?jí)A甲(河南竹林眾生制藥公司)，氯胺酮(福建古田藥業(yè)公司),山羊抗ChAT多克隆抗體(Cemicon)。

1.2動(dòng)物分組及模型制備20月齡雄性Wistar大鼠(甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)經(jīng)篩選剔除體重過大或過輕及在水中不游動(dòng)的，共選出動(dòng)物32只，體重500～550g。按體重分級(jí)，隨機(jī)分成4組：對(duì)照組,麻醉組,手術(shù)組，石杉?jí)A甲組(n=8)。其中石杉?jí)A甲組給石杉?jí)A甲灌胃，0.15mg·kg-1·d-1，溶于生理鹽水中，連續(xù)灌3w，對(duì)照組、麻醉組、手術(shù)組均按體重給與同容量的生理鹽水灌胃3w，3w后手術(shù)組和石杉?jí)A甲組在氯胺酮腹腔注射(25mg/kg)麻醉下行脾切除手術(shù);麻醉組僅給與氯胺酮麻醉，不行手術(shù);對(duì)照組僅腹腔注射同容量的生理鹽水。

1.3學(xué)習(xí)、記憶功能的行為學(xué)測(cè)試通過Morris水迷宮測(cè)試,將圓池內(nèi)壁和平臺(tái)漆成黑色，將其分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第4象限沒入水下約2cm，選擇一個(gè)象限的固定位置作為大鼠入水點(diǎn)，通過自動(dòng)圖像拍攝系統(tǒng)記錄游泳軌跡，入水至找到平臺(tái)為潛伏期,其總行程為游泳距離〔3〕。術(shù)前學(xué)習(xí)5d，每天測(cè)試4次，取其平均值，術(shù)后1、3、7d分別進(jìn)行測(cè)試，并于術(shù)后7d撤掉平臺(tái)，記錄60s內(nèi)大鼠在每個(gè)象限的停滯時(shí)間和在每個(gè)象限游泳的距離。

1.4免疫組化染色

1.4.1灌注和切片大鼠行為學(xué)觀察結(jié)束后，氯胺酮(25mg/kg)腹腔麻醉動(dòng)物，暴露心臟，以0.9%生理鹽水經(jīng)升主動(dòng)脈灌注沖洗后，灌注4%多聚甲醛(pH7.4)900ml，持續(xù)2h后取腦，將腦置于20%蔗糖的PBS溶液中浸置24～48h(4℃)，冰凍冠狀連續(xù)切片(厚度30μm)，海馬組織每5張取1張。

1.4.2免疫組化染色步驟切片置于0.3%Triton中浸30min，PBS液洗3次，每次15min;在稀釋濃度為1∶2000的山羊抗ChAT多克隆抗體中孵育72h(4℃);PBS液漂洗后在生物素標(biāo)記二抗(1∶100)中,室溫下孵育1h;辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(1∶100)中,室溫下孵育1h;二氨基聯(lián)苯氨(DAB)反應(yīng)液中成色,室溫下10～20min;常規(guī)明膠裱片、脫水、DPX封片。為了計(jì)算ChAT細(xì)胞數(shù)目，采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格的技術(shù)方法，在100倍的光鏡下做ChAT細(xì)胞計(jì)數(shù)，以“500×400μm”為單位，結(jié)果取3個(gè)視野的平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以x±s表示，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1水迷宮測(cè)試結(jié)果術(shù)后1d麻醉組、手術(shù)組的逃避潛伏期和游泳距離延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后3d僅手術(shù)組，石杉?jí)A甲組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且數(shù)值達(dá)高峰;術(shù)后7d手術(shù)組與對(duì)照組比較有差異(P<0.05),但差距已明顯縮小;術(shù)后石杉?jí)A甲組與手術(shù)組比較均有差異(P<0.05)。石杉?jí)A甲組術(shù)前的逃避潛伏期和游泳路程較對(duì)照組有明顯差異(P<0.05)，見表1。與對(duì)照組(26.5%)、麻醉組(26.3%)、石杉?jí)A甲組(26.5%)比較，術(shù)后7d在60s內(nèi)手術(shù)組(24.1%)的平臺(tái)象限停滯時(shí)間百分比減小(P<0.05)，與對(duì)照組(24.5%)、麻醉組(24.2%)、石杉?jí)A甲組(24.7%)比較，術(shù)后7d在60s內(nèi)手術(shù)組(22.8%)的平臺(tái)象限游泳距離占總游泳距離百分比減小(P<0.05)。這些結(jié)果說明脾切除術(shù)后大鼠在水迷宮測(cè)試中的空間認(rèn)知能力受到損害，單次使用氯胺酮僅引起極短期的認(rèn)知減退，而石杉?jí)A甲組減弱了脾切除術(shù)后大鼠在水迷宮測(cè)試中學(xué)習(xí)記憶能力的損害。表1各組大鼠的逃避潛伏時(shí)間、游泳路程1)與對(duì)照組比較，2)與手術(shù)組比較：P<0.05

2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果術(shù)后7d水迷宮測(cè)試后，海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元在對(duì)照組、手術(shù)組和石杉?jí)A甲組的表達(dá)率分別是(68.17±3.02)、(80.15±2.18)和(70.31±2.56)，手術(shù)組海馬CA1區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組、麻醉組(69.04±2.37)和石杉?jí)A甲組都增多(P<0.05),而對(duì)照組、麻醉組和石杉?jí)A甲組的ChAT陽性細(xì)胞數(shù)相當(dāng)，見圖1。

3討論

Moller對(duì)1218例60歲以上的老年患者進(jìn)行了POCD的調(diào)查研究〔4〕，發(fā)現(xiàn)25.8%的患者在術(shù)后1w出現(xiàn)了POCD，術(shù)后3個(gè)月9.9%的患者出現(xiàn)POCD，而相近年齡對(duì)照組患者的發(fā)生率分別為3.4%和2.8%，POCD對(duì)大多數(shù)患者來說是可逆的，但仍有少數(shù)患者存在長(zhǎng)期甚至永久的認(rèn)知功能障礙〔5〕。

脾切除手術(shù)對(duì)大鼠的機(jī)體影響較小，術(shù)后大鼠可以如期進(jìn)行水迷宮測(cè)試。術(shù)前水迷宮測(cè)試成績(jī)石杉?jí)A甲組明顯好于其他組，說明石杉?jí)A甲可以改善大鼠的認(rèn)知功能，與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相符〔4〕。術(shù)后1d，麻醉組、手術(shù)組空間記憶力低于對(duì)照組，石杉?jí)A甲組不低于對(duì)照組，但呈下降趨勢(shì),表明手術(shù)組學(xué)習(xí)記憶功能下降;術(shù)后3d，麻醉組記憶力恢復(fù)，手術(shù)組、石杉?jí)A甲組進(jìn)一步減退，石杉?jí)A甲組也低于對(duì)照組，但石杉?jí)A甲組與手術(shù)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示石杉?jí)A甲具有改善POCD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能;術(shù)后7d，僅手術(shù)組與對(duì)照組的差異明顯縮小,提示老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力正在恢復(fù)。麻醉組單純應(yīng)用氯胺酮，記憶力僅術(shù)后一天較低，以后恢復(fù)。文獻(xiàn)報(bào)道反復(fù)應(yīng)用小劑量氯胺酮可引起認(rèn)知功能障礙〔5〕，單次使用可能僅引起極短期的認(rèn)知減退。

研究表明中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)在學(xué)習(xí)和記憶功能中起主要作用，分布于海馬結(jié)構(gòu)中的膽堿能纖維與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)〔6〕，許多年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙都有海馬膽堿能系統(tǒng)活力下降,ChAT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成Ach過程中重要的酶,研究中采用免疫組化技術(shù)觀測(cè)了海馬CA1區(qū)ChAT的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)POCD模型大鼠海馬CA1區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)目增多,而研究表明海馬ChAT陽性神經(jīng)元減少與大鼠癡呆發(fā)生密切相關(guān)〔7〕。造成此結(jié)果有兩種可能因素，一是由于機(jī)體為防止輕度認(rèn)知功能障礙加重并轉(zhuǎn)化為永久性癡呆而導(dǎo)致海馬CA1區(qū)ChAT活性上調(diào)〔8〕。另一種因素，可能是POCD大鼠的膽堿能神經(jīng)進(jìn)行了代償性機(jī)能上調(diào)，但這種變化與認(rèn)知功能的具體關(guān)系機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

石杉?jí)A甲生物堿是從蛇足石杉中分離得到的一種新生物堿,是一種高效可逆的膽堿酯酶抑制劑,其改善、促進(jìn)學(xué)習(xí)、記憶過程的作用已有定論〔2〕。研究〔9〕表明，石杉?jí)A甲對(duì)成年、老年嚙齒類動(dòng)物及老年猴有促智作用，石杉?jí)A甲改善學(xué)習(xí)、記憶的作用呈典型的鐘形量效關(guān)系，劑量過大則損害記憶功能。給予石杉?jí)A甲0.01～0.50mg·kg-1·d-1，均能明顯增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶功能。因此選擇石杉?jí)A甲灌胃，0.15mg·kg-1·d-1,為確保療效連續(xù)用藥3w〔10〕。超級(jí)秘書網(wǎng)

乙酰膽堿是腦內(nèi)廣泛分布的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與記憶與認(rèn)知功能。老年大鼠的皮層膽堿能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)密度降低，在非病理性老化中都不同程度存在腦中乙酰膽堿生成和釋放的減少，因此全麻手術(shù)后早期譫妄好發(fā)于老年大鼠。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示石杉?jí)A甲的干預(yù)穩(wěn)定了海馬膽堿能系統(tǒng)，改善了POCD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶的功能。

綜上所述，老年大鼠脾切除手術(shù)后早期可發(fā)生認(rèn)知功能障礙，并在術(shù)后3d左右達(dá)高峰，以后逐漸恢復(fù)，單次使用氯胺酮僅引起極短期的認(rèn)知減退，預(yù)先給予石杉?jí)A甲能夠減輕大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

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